2022年1月22号，国际权威学术期刊《Frontiers in Plant Science》（《植物科学前沿》）一区，发表了我国植物病理学家，云南农业大学何月秋教授科研团队的最新科研成果----《用柑橘内生枯草芽孢杆菌L1-21战胜柑橘黄龙病病原菌》科研论文.这是世界上第一篇柑橘本主内生菌防控黄龙病的科研论文，是世界上第一个成功的规模化防控黄龙病的生物技术，标志着全球防控黄龙病的研究获得实质性进展，具有划时代的意义。
众所周知，黄龙病是一种韧皮杆菌引起的毁灭性的柑橘病害。由于病害防控极其困难，病菌不能进行培育研究等诸多因素，自1919年发现黄龙病害到现在一百多年，世界各地始终不能有效防控，且目前预防措施的效果也不理想，成为一种世界性的重大病害。许多国家和地区因为黄龙病而将柑橘病树砍伐和焚烧，不能继续种植，是世界柑橘产业发展的最大技术障碍。
为攻克这个阻碍世界柑橘产业发展的最大病害，以云南农业大学何月秋教授为首组建的国内外专家团队，采用新思路、发明新方法，提取的柑橘本主靶标内生菌，经过多年、多地区、多园区的规模化实践应用，取得理论和实践应用的重大成功。本项目通过2019年和2021年两次专家组评审，证实本技术能够有效防控黄龙病菌，在世界上首次打破了黄龙病是柑橘绝症的魔咒。
2021年生物防控黄龙病鉴评会
科研团队发明了一种在离体检测内生菌L1-21抑制黄龙病菌作用机理的半叶法新方式。病菌数量在104（cfu/g）条件下，施用L1-21内生菌4天内，每克叶中脉的CLas拷贝数减少了1000倍（107—104cfu/g）。在发生黄龙病两年的柑橘园中，用内生菌L1-21处理植株，CLas的发病率降低到<3%，CLas在病叶中脉的拷贝数从109g-1下降到104g-1。病菌数量的降低直接证实内生菌的防控作用，红色荧光蛋白标记的L1-21内生菌抢占了CLas生态位（韧皮部），能够从病树中成功地消除CLas。这是世界上首创利用柑橘本主内生菌防控黄龙病的技术，也是世界上第一个成功的规模化防控黄龙病的生物技术。
论文最后着重讨论柑橘本主内生菌与黄龙病菌之间的关系。研究发现柑橘树中黄龙病菌的数量与内生菌数量成反比。利用新型半叶法，以潜在生防内生菌B. subtilis L1-21处理柑橘HLB病叶的结果表明，处理罹病柑橘叶片可使叶片中脉的病原菌数量降低1000倍。此外，柑橘内生菌L1-21的韧皮部定位也证实了其可能的病原菌拮抗作用。这种内生菌可以有效地定殖柑橘叶片的韧皮部，为进一步研究内生菌与维管病原菌相互作用的机制提供了新的思路。本研究首次揭示了本主内生菌重塑柑橘内生微生物菌群，能够防控柑橘毁灭性的黄龙病。
本技术规模化用效果展示：
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本菌株转化的商品简介：
1、本菌株对由韧皮部杆菌、黄单胞杆菌、欧文氏杆菌等引起的柑橘黄龙病、溃疡病、角斑病、软腐病等细菌性病害具有高抗性，显著抑制病原菌生长。改善植株的微生态环境，促使作物叶片快速退黄转绿，逐步恢复正常。
2、增强作物光合作用，促进植株生长发育，显著提高作物坐果率和果品品质。
3、本品为纯生物制剂，对昆虫、动物、和人类以及环境等友好，无任何危害，可用于所有作物和有机农业种植。
（中文译本全球首发）
用柑橘内生枯草芽孢杆菌L1-21战胜柑橘黄龙病病原菌
Shahzad Munir1，李咏梅1，何鹏搏1，何鹏飞1，何朋杰1，崔文艳1，吴毅歆1，李兴玉1，李奇1，张思翔2，熊杨苏2，卢占军3，王文彪2，宗克贤2，杨永超4，杨绍聪5，沐婵5，文和明4，王跃虎6，郭俊7，Samantha C. Karunarathna，8何月秋1*
1、云南省生物资源保护与利用国家重点实验室，云南农业大学，中国昆明
2、宾川县食品药品检测研究所，中国宾川
3、赣南师范大学生命科学院，中国赣州
4、文山州农业科学院旱地作物研究所，中国文山
5、玉溪市农业科学院作物施肥研究所，中国玉溪
6、中国科学院昆明植物研究所经济植物与生物技术重点实验室，中国昆明
7、云南省农业科学院热带和亚热带经济作物研究所，中国保山，
8、中国科学院昆明植物研究所山地未来中心，中国昆明
黄龙病（HLB）是一种由亚洲韧皮杆菌（CLas）引起的毁灭性的柑橘病害。然而，从发现黄龙病害到现在始终不能进行有效防控。本技术通过施入从健康柑橘中分离的一株本主内生枯草芽孢杆菌--L1-21，能够恢复罹病柑橘中受影响的微生物群，为减少黄龙病菌数量提供一种新的方法。本文还发明了一种在离体检测内生菌L1-21抑制CLas作用机理的半叶法。病菌数量在104（cfu/g）条件下，施用L1-21内生菌4天内，每克叶片中脉的CLas拷贝数减少了1000倍（107—104cfu/g）。在发生黄龙病两年的柑橘园中，用内生菌L1-21处理植株，CLas的发病率降低到<3%，CLas在病叶中脉的拷贝数从109g-1下降到104g-1。病菌数量的降低直接证实内生菌的防治作用，红色荧光蛋白标记的L1-21内生菌抢占了CLas生态位（韧皮部）。本文为首次大规模地利用本主内生菌，建立柑橘内生微生物菌群的方式构建黄龙病可持续防控策略。
关键词：柑橘，枯草芽孢杆菌，内生菌，病原菌，重组，微生物菌群
引言
黄龙病（HLB）是一种柑橘树无法防控的毁灭性病害，能够造成产量和品质的严重影响。是由一种或多种韧皮部寄生的亚洲韧皮杆菌（CLas）、非洲韧皮杆菌（CLaf）和美洲韧皮杆菌（CLam）引起（Bové，2006）。由于宿主营养物质的消耗、竞争和损耗 ，CLas可能会导致宿主代谢失衡（Duan等，2009）。CLas的主要媒介是亚洲柑橘木虱（ACP， Diaphorina citri）（Narouei Khandan等，2016年），了解植物-病原菌相互作用的机制，对于黄龙病防控新策略的开发至关重要（Albrecht and Bowman，2008；Fan et al.，2011）。
HLB症状的特征包括斑驳状和淡黄色的叶子，随后是明显的黄梢、叶脉软化、植株变矮、红肩果（红鼻果）、嫩梢枯死（Ajene et al.，2020）。还观察到，受感染植物的须根数量显著减少，从而导致根系发育不良（Johnson等，2014年；Li等，2019年）。没有经过专业培训的人员，很难将感染黄龙病的植株与营养缺乏症状区别开来（Tian等，2014），因为病原菌分布总是非常不均匀，且叶和茎含有大量细菌（Li等，2006年）。发病初期，根部的病菌量可能最高（Johnson等，2014年；da Rocha等，2019年）。与温暖月份相比，寒冷季节时症状更清晰明显。Shimwela等（2019年），黄龙病潜伏期大约数月至数年。目前尚不清楚植株在出现症状之前被感染了多长时间，但有病菌的柑橘树最终会出现症状（Dala Paula等，2019年）。
到目前为止，还没有任何有效的方法来防控这种病害，但是，科学家们还是采用了一些控制措施来预防或减少病害的发生。目前控制黄龙病的方法包括频繁使用抗生素，如青霉素（Shin等，2016年；Asconce等，2019年；McV ay等，2019年）和土霉素（Blaustein等，2018年）；小分子抑制剂筛选（Pagliai等，2015年）；砧木和接穗的组合（Albrecht等，2016年）；基于嫁接的化疗（Zhang et al.，2012；Y ang et al.，2016）和转基因技术（Hao et al.，2016；Zou et al.，2017）；虫媒昆虫木虱的控制（Tomaseto et al.，2019）等；最后，最极端的措施是砍掉并烧毁病树，这会造成更严重的环境污染。这种方法可能会减缓病害发展速度，但还是会带来巨大的损失。
然而，生物防控是病害连续防治失败最有希望的替代方法，内生菌介导的生物防治由于其与寄主密切相关，且与病原菌共享生态位，从而充分显示其拮抗潜力，因此防控结果稳定一致。而在田间条件下，由于根际竞争激烈和环境条件恶劣，非内生菌的菌株往往容易失效（Ahmed et al.，2020；Blacutt et al.，2020；Trivedi et al.，2020）。采用生物防治方案，本主内生菌能够在柑橘寄主内部长期定殖，并通过竞争生态位和营养来清除CLas（Munir等，2018b）。在实验室条件下，使用细菌进行植物病原菌的生物防治效果较好（Herschkovitz等，2005年；Andreote等，2010年；Dematheis等，2013年），而在田间条件下效果适中（MattosJr等，2020年），但是本主内生菌作为经济实用的柑橘病原菌生防菌株尚未被研究，特别是对于黄龙病的生物防控，从没有人做过研究（Munir等，2021年）。这种生物防控柑橘病害的方法，会带来一场新的革命（Bové，2006）。
植物病害发生和各种植保措施会导致宿主微生物菌群的紊乱（Irigoyen等，2020年）。显然，在黄龙病发病期间，CLas与微生物种群动态变化相关（Zhang等，2013a，2016年；Munir等，2019年）。因此，了解主要内生细菌对柑橘健康和抵御HLB的影响，具有极其重要的意义。有研究表明CLas的关键抑制剂在抑制病原菌中起着重要作用（Barnett等，2019年）。
经过深入研究，本科研团队测定从健康柑橘树中分离出来的本主内生菌L1-21(根据对几种细菌和真菌病原菌的潜在生防活性选择到的菌株)对病树中CLas的防治效果。本研究发明了利用一种新的柑橘半叶测定法，在L1-21存在下减少CLas的有前景的研究结果。 本研究报告，选择两个田间实验结果，其中一处树龄16年和另一处树龄为4年。本团队特别发现，红色荧光蛋白(RFP)标记的内生L1-21与柑橘韧皮部中的CLas共享一个生态位。据我们所知，本研究是世界上以柑橘内生菌规模化持续防控HLB的第一个研究案例.
材料与方法
细菌菌株和培养条件
内生菌菌株枯草芽孢杆菌L1-21（Bacillus stubilis L1-21)是从健康柑橘植株(Munir et al.， 2020a)中分离到的柑橘本主内生菌，并保存于中国国家菌种北京保藏中心(收录号: CGMCC15726)，选择该内生菌用于温室和柑橘田间试验(云南宾川)。内生菌L1-21及其RFP标记菌株在40%甘油（v/v）中储存于−80℃。在Luria Bertani（LB）琼脂上每4个月更新一次，菌种培养24-48小时，以检查潜在内生菌的稳定性。内生菌L1-21在37℃的摇床中(150转/分)，以LB培养24-48小时，直至对数生长后期。检测菌量(cfu/ml)后，以0.1% Tween 20稀释，使用时喷施在柑橘树叶面上。
新的柑橘半叶法
我们设计了一种基于常规和定量PCR (qPCR)的柑橘半叶检测方法，用于检测处理前后柑橘叶片中CLas拷贝数。从16年生的柑橘园中随机采集罹病的柑橘叶，将其置于冰中，带到实验室，立即进行试验或在4◦C存储备用。首先，使用CTAB法（Araújo等，2002年；Munir等，2019年）从一半的病叶中提取DNA，进行常规PCR分析，并使用引物对Cal-R/Cal-F（Jagoueix等，1996年）,然后使用引物对CG03F/CG05R（Zhou等，2007年）做巢式PCR分析，确认“亚洲韧皮杆菌”。本研究中使用的引物见附表S1。一旦确认CLas呈阳性，另一半柑橘叶（4–5cm）与104-106cfu/ml内生菌一起悬浮在5ml的试管中，使用不同的抗生素，如青霉素（100µg/µl） 溶于蒸馏水中，多杀菌素（100µg/µl）溶解于正己烷溶液，申嗪霉素（100µg/µl） 溶于蒸馏水中作为化学对照（阳性）。LB液体培养基与蒸馏水作为对照（阴性）。重复上述做法，扩增CLas 16S核糖体RNA基因片段（16S rRNA）（Munir等，2019年）。这个试验重复5次。将扩增产物上样于1%琼脂糖凝胶上，检测其对CLas的处理效果。在另一个测试CLas和内生菌数量的试验中，将病叶放置在培养皿（180 mm）中进行不同的处理。利用CTAB方法（Araújo等，2002年）从一半的病叶中提取DNA，并使用前面描述的相同引物进行扩增。一旦叶片被证实感染了CLas，则将叶片的另一半放入直径180毫米的培养皿，培养皿中加入104和106 cfu/ml 或溶于蒸馏水的青霉素(100µg/µl)溶液中。LB和蒸馏水作为对照。将培养皿置于室温下，间隔1天，检测叶片中病原菌和内生菌的浓度，连续检测4-5天；然后，从中脉中提取DNA并分离现有的内生菌(Araújo et al.，2002；Munir等，2018b)。试验前记录每半片叶子的重量。每个处理3个重复，每个重复12片病叶片(随机选择6个上半叶和6个下半叶)，重复试验5次。通过标准qPCR分析确认了病原菌的存在，并根据核糖体蛋白(rplJ)基因中特定DNA片段克隆382 bp，制作标准曲线，计算拷贝数/克叶中脉(Munir等，2020a)。参照Wang等(Wang et al.， 2006)，PCR反应在含有1×PCR缓冲液的25µl反应混合物中进行（SYBR Green Master Mix；美国Bio-Rad），每种引物（CQULA04R/CQULA04F）为0.8µl，适当数量的DNA模板(Stepone Real-Time PCR系统，Applied Biosystems，美国)。根据使用之前制作的标准曲线计算出的柑橘叶片病原菌拷贝数/克叶中脉的CT值，在0 - 4天内检测CLas拷贝数的变化；每天记录柑橘叶片中脉内生菌数量的变化，记录为log cfu/ g。
枯草芽孢杆菌L1-21 的RFP菌株在韧皮部的定殖
为了确认内生菌在韧皮部定殖，利用基因组DNA扩增带有核糖体结合位点的mKate2编码序列，生成了带有RFP标记的L1-21菌株。如前所述（Chai等，2008），Bam H1和Hind III酶用于扩增产物消化和质粒pYC127酶切，连接产物与质粒，得到质粒PY69，用于构建过表达L1-21的RFP菌株。在含有10µg/µl氯霉素的LB培养基中，在37℃摇床中，将表达红色荧光报告基因(mKate2)的菌株培养到对数晚期。用RFP标记的内生菌株L1-21叶面喷施温室2年生柑橘植株，2天后用共焦激光扫描显微镜（CLSM）观察其定殖情况。摘下柑橘叶片轻轻清洗，按以前的方法进行表面消毒，去除柑橘叶面上的细菌（Munir等，2021年）。添加最佳切片温度（OCT）化合物（Sakura，Europe），将分离的叶片中脉置于标本支架上。将柑橘叶中脉的标本支架夹在低温切片机上（美国徕卡生物系统公司）简易地切片。使用CLSM（Olympus，FV10-ASW）检查切片中脉。在559nm激发后，在405至635nm处测量RFP的发射情况，而在405和635nm激发后，分别测量柑橘植物自身的蓝色荧光和绿色荧光。使用自动图像程序FV1000 Viewer捕捉图像。试验做了3次，每次3个重复。
研究地点和感染HLB柑橘园样本的制作
实验地点位于中国云南省大理市宾川（100.5754）◦ E、 25.8272◦ N），年平均气温为33-35℃，年总降雨量约1000毫米。在16年树龄的柑橘园中，CLas发病率>90%。第二个树龄4年的柑橘园距离第一个柑橘园2公里，在试验开始前通过常规PCR和qPCR证实，CLas感染率为100%。2017年至2019年进行了两次田间试验：在第一个柑橘园中，162株树（附图S1）进行了对比处理，在第二个柑橘园中，525株树中选择了93株（31株树的3个重复）进行CLas菌量检测。在每个试验开始之前，都进行了实地调查，以直观地确定单株黄龙病的严重程度，并在qPCR分析中使用CLas特异性引物量化CLas数量。柑橘园的土壤处理包括肥料1（油菜籽枯饼与解淀粉芽孢杆菌Y2，作为根系生长促进剂）；肥料2（不含解淀粉芽孢杆菌Y2的油菜籽枯饼）和不含油菜籽枯饼作为对照（F0）。试验开始时，通过树干注射1次抗生素青霉素(100µg/µl)水溶液，如附表S2所示。此外，我们在每株树周围的滴水线，开大约20厘米深㳀沟，施用5公斤肥料。本研究中使用的抗生素和内生菌见附表S2。
田间内生菌应用
在田间试验中应用内生菌。每株树的两个注射口是用7.14厘米的钻头钻入木质部组织30毫米，位于树干两侧，离接穗上方20厘米处。使用推荐压力（<50 psi）的微滴注射器将抗生素和内生菌（L1-21）从加压瓶中注入每个孔口。第一次注射青霉素（0.1%）在54株树上进行4天，27株树作为对照。在抗生素治疗2周后，第二次在54株树上注射内生菌（106 cfu/ml）。我们还每月在27株树上喷施106 cfu/ml的内生菌或青霉素，每次在清晨或傍晚进行，直到所有叶子都变湿为止。所有试验均采用随机完全区组设计，由3株树组成1个重复，重复3次。
柑橘树内生菌的分离
引起黄龙病的亚洲韧皮杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)对本主内生微生物菌群有不利影响。因此，我们从每株树取叶片6片，重复3次，以评估内生细菌的数量。取样后，置于冰中带回到实验室。在2017-2018年每个月第一周采集叶片样本。内生菌分离参照（Araújo等，2002年）。
黄龙病菌DNA提取和PCR扩增
每月从柑橘园采集所有处理植株的叶片样本，以测定CLas浓度。在提取DNA之前，叶片按上述方法处理。DNA提取、PCR和qPCR的方法如前所述。
统计分析
根据平均对数（以10为底）的cfu值计算内生细菌数量，并使用GraphPad Prism版本8（San Diego, California, USA）进行分析。使用标准曲线值计算罹病柑橘叶片的病原菌拷贝数/g (Munir等，2020a)。采用SPSS统计软件22.0版（IBM Corporation，Armonk，New York，USA）中的方差分析对治疗效果进行检验，并使用Duncan做多重比较分析（p<0.05）。
结果
枯草芽孢杆菌L1-21在实验室内对CLas的抑制作用
我们使用内生菌B. subtilis L1-21通过柑橘半叶法(图1A、B) 对抗叶中脉中的CLas，并在室温下保存在Eppendorf试管中。在104和106 cfu-ml的内生菌处理后5天，叶脉中的CLas拷贝数减少（图1C）；同样，本试验中使用的抗生素也减少了CLas拷贝数（图1D）。随后检测叶片中的内生菌验证了这一结果，证实了单次施用内生菌可以减少柑橘叶片中脉中的CLas拷贝数。
为了进一步证实内生菌对CLas的有效性，我们使用半叶法测试了在培养皿中存在的一半叶中的病原菌，该培养皿用L1-21（104和106 cfu/ml）处理一次） 或青霉素（作为阳性/化学对照）和LB液体培养基与水作为阴性/未处理对照。通过标准qPCR分析确认病原菌的存在，并根据标准曲线计算病菌量(拷贝/g) (Munir等，2020a)。用内生菌L1 -21(104和106 cfu/ml)、青霉素、LB和水处理前的叶片中脉中CLas病原菌拷贝数分别为1.12 × 107、1.23 × 106、4.71 × 105、2.38 × 105和1.51 × 106(图1E；附表S3)。施用内生菌106 cfu/ml和104cfu/ml处理后4天，叶片中脉CLas拷贝数分别减少1000倍(1.12 × 107 ~ 3.72 × 104拷贝/g)和100倍(1.23 × 106 ~ 3.93 × 104拷贝/g) (图1F；附表S3)。在治疗4天内，施用青霉素使病柑橘叶片中的CLas减少10倍（4.71×105至1.64×104拷贝/g），并且LB或水分对照中CLas拷贝数没有减少。这些结果清楚地表明，应用内生菌可以减少柑橘病叶中的CLas病原菌。使用半叶法从叶片的顶部和底部检测病原菌的减少情况，验证结果的有效性，表明3-4天后，CLas病原菌数量降低了90%以上(附表S4)。
图1 柑橘半叶法在0到4天内减少罹病柑橘叶片中的亚洲韧皮杆菌（CLas）。
柑橘新半叶试验用柑橘叶示意图（A）出现黄龙病(HLB)症状的整片柑橘叶;（B）叶子被分成两部分；第一部分采用常规和定量PCR（qPCR）检测CLas病原菌；确认后，第二部分用于枯草芽孢杆菌（B.subtilis）L1-21处理的试验。红色箭头表示叶中脉，用于常规和qPCR提取DNA; （C）用内生菌(103 -106 cfu/ml)和抗生素青霉素(100µg/µl和500µg/µl)、申嗪霉素(100µg/µl)和多杀菌素(100µg/µl)处理常规PCR和病害柑橘叶片；9号泳道，水对照；10号泳道，阳性对照；（D） 常规PCR，应用前；泳道1，用青霉素处理的柑橘叶样品；泳道2，用多杀菌素处理的叶片样品；泳道3，用申嗪霉素处理的柑橘叶；泳道4，在LB培养基中用内生菌处理样品，不振荡培养；第5条和第6条，在摇床上分别在LB液体培养基中和水中样本；泳道7和15，病柑橘叶仅在水中浸泡; 8号和16号泳道，阳性对照；使用后：第9泳道，青霉素；10泳道，多杀菌素；11泳道，申嗪霉素；泳道12，内生菌在LB培养基中处理，无需摇动；泳道13，内生菌在LB培养基中摇动处理；14泳道，样本在水中摇动；（E） qPCR，每克叶片中脉使用104和106菌落形成单位(cfu/ ml)处理一次。根据qPCR生成的重组质粒pUC18-382-HLB的标准曲线计算病原菌拷贝数/g。青霉素作为阳性对照。LB培养基和水作为阴性对照。每个处理使用3个生物重复，每个重复由12片病叶组成（包括上半叶和下半叶各6片）。实验重复5次。（F）病原菌拷贝数/g片叶中脉，使用104和106 cfu/ml内生菌和水处理1次。这些值是5个重复实验的平均值±标准差。
枯草芽孢杆菌L1-21增生柑橘叶片内的本主内生菌
在施用内生菌L1-21之前，柑橘叶片内的本主内生菌密度为105 cfu/g。在使用内生菌株L1-21进行单一处理后，叶片内存在的其他内生菌的密度增加到109 cfu/g（图2A）。处理叶片内生菌L1-21在LB培养基上呈粉红色菌落，各不同处理的柑橘病叶片在不同的时间间隔内均获得了内生细菌L1-21（图2B）。青霉素最初降低了叶片中脉微生物数量，但随着时间推移，内生菌数量慢慢地恢复到处理前的水平。内生菌数量不受LB和水处理的影响。
图2 柑橘半叶法应用L1-21后提高本主内生菌
（A） 施用内生菌、青霉素和阴性对照后，染病柑橘叶片的本主内生菌密度。（B） 不同处理时间间隔对柑橘病叶片内生菌的恢复情况。根据从植物叶片中恢复的细菌的平均对数(以10为底)计算内生细菌的数量。以检测限(1 × 102 cfu每叶)为log 0进行均值计算。使用GraphPad Prism版本8（San Diego, California, USA) 分析对数cfu值。这些值是5次重复实验的平均值±标准差。
枯草芽孢杆菌L1-21在柑橘韧皮部中的定殖
为了证明柑橘中脉韧皮部内的本主内生菌L1-21定殖有助于清除在柑橘韧皮部的CLas的假设，构建了一个RFP标记的L1-21菌株，该菌株可表达mKate2基因。通过CLSM观察，我们发现RFP标记的L1-21成功地定殖到柑橘中脉（图3）。接种两天后，我们观察到韧皮部内存在大量L1-21菌体。这些结果表明，内生菌L1-21不仅完全定殖于柑橘韧皮部，而且如上所述还降低了柑橘韧皮部中病原菌数量。
图3 枯草芽孢杆菌L1-21在柑橘叶片中脉韧皮部的定殖
（A–E）在温室中，将表达mKate2的本主柑橘内生菌生长至对数后期，并喷洒在柑橘叶片上。用激光共聚焦扫描显微镜观察枯草杆菌L1-21红色荧光蛋白（RFP）在韧皮部的分布；（A）柑橘叶中脉的横切面显示红色荧光（韧皮部）；绿色自发荧光（叶绿素）；蓝色荧光为木质部。（B） 放大图A中观察到的柑橘叶脉韧皮部内生菌详细定殖情况;（C）枯草杆菌L1-21-RFP的个体；（D）木质部呈蓝色自发荧光；（E）叶绿素产生的绿色自发荧光；（F）深色区域显示柑橘韧皮部。标尺刻度为30µM。白色和黄色箭头代表定位于韧皮部内的RFP标记的枯草杆菌L1-21。
短期田间应用枯草芽孢杆菌L1-21减少CLas的效果
2017年至2018年，在16年生和4年生的柑橘树的两个罹病柑橘园（黄龙病病株率>90%和100%）中，测试了L1-21对CLas的防效。我们通过对比应用内生菌、抗生素和生物肥料来处理感染CLas的柑橘园，以确定最有效的管理策略（附图S1）。用本主内生菌成功治愈6-7个月后，受黄龙病影响的柑橘园完全恢复（附图S1B，C）。在试验开始时，施用一次抗生素和生物肥料，每月施用一次内生菌，然后采集叶片，检查CLas和内生菌的密度。在试验开始之前，对所有柑橘树进行了测试，以确定每株树内存在的内生菌总数（图4A）。由于施用了L1-21的柑橘树上的L1-21扩散到了邻近未经处理的植株(附图S2)，因此，各植株中每个月均检测到了内生菌L1-21。使用常规和巢式PCR技术，每月在162株柑橘树的叶片样本中测量CLas和内生菌的密度（图4B-D）。用内生菌处理1年后，叶片健康状况得到改善，叶片由黄色变为绿色，我们发现CLas对柑橘树的内生微生物群有负面影响。我们每月调查柑橘树症状，发现第=每月施用一次内生菌L1-21，病树中CLas的密度显著降低。在试验的第一个季度，罹病树数量减少到不到100株，特征是这些黄色斑驳叶子的植株开始长出更健壮的嫩梢和叶片。施用抗生素后，柑橘内生菌的叶片密度开始降低，但后来恢复到107 cfu/g以上。到试验的第二季度，病树数量减少到69株，内生菌密度也有所增加；到了最后一个季度，病树数量减少到了3株，果园中植株最终结出了商品果实。因此，我们证实了内生菌L1-21是防控黄龙病最有效的菌株，也是全世界柑橘种植者可靠且廉价的选择。通过树干注射和叶面喷施，利用具有多种拮抗活性的内生菌加强柑橘微生物种群数量，使CLas容易得到控制（图4E）。对比之前我们发现病树中的内生菌数量较少的现象，这表明更高数量的本主柑橘内生菌可能有助于控制病树中的CLas（Munir et al.，2019）。
图4 内生菌数量和CLas病原菌减少情况
（A） 2017年3月，在开始试验之前，对罹病的柑橘树进行了内生菌评估；（B） 2017年4月，肥料1处理的所有植株均加入解淀粉芽孢杆菌Y2；X轴代表内生菌和青霉素注射（1）；内生菌注射（2）；青霉素喷雾剂（3）；内生菌喷雾剂（4）；青霉素注射液（5）；对照组CK1和CK2（6,7）；（C） 肥料2加解淀粉芽孢杆菌Y2；CK2和CK3（6,7）；（D） 不使用有机肥（F0）作为对照；（6,7）原生内生菌数量增加，这是由于内生菌在所有植株甚至对照中扩散所致;（E） 不同采样时间内生菌种群数量；（F）利用常规PCR和(G)巢式PCR连续检测处理降低病树中CLas病原菌。根据从植物叶片中得到的细菌平均对数（以10为底）计算内生细菌的数量。使用GraphPad Prism版本8（San Diego, California, USA)分析对数cfu值。数值为平均值±标准差，不同字母的不同处理之间的差异具有统计学意义（p≤ 0.05)
每个月施用L1-21后6个月，叶片样本中CLas的拷贝数减少（图4F、G），证实了我们的假设，即柑橘本主内生菌可将黄龙病田间发病率降低95%以上（附图S3A-D）。在大多数植株树上，每月施用一次内生菌，1年后，柑橘叶中脉中L1-21的数量从103个增加到约109 cfu/g左右。表明本主内生菌可能代表了一种控制柑橘类植物中CLas的新管理策略（图5）。我们在研究区域的其他2个柑橘园和云南省耿马县也发现了这种内生菌对CLas的类似作用(图6)。
图5 在中国云南省宾川县施用内生菌L1-21前后，黄龙病对柑橘园的影响
在试验开始之前，对柑橘园进行CLas病原菌检测，以确保所有柑橘树都受到HLB的影响。（A，C，E）2017年3月，柑橘园受到HLB的影响；（B，D，F）2017年6月，施用L1-21后，柑橘树生长更加旺盛，叶片呈绿色。
图6 利用内生枯草芽孢杆菌L1-21在耿马县防控柑橘黄龙病结果
2018年，在中国云南省耿马县的一个柑橘园中进行了一项试验，以检查减低病害严重程度的效果。在使用柑橘本主内生菌L1-21进行7-8个月的常规治疗后，植株表现出病害症状减轻，直至恢复健康状态。（A） 2018年4月；（B） 2018年6月；(C) 2018年11月（中国云南省耿马县）。
枯草芽孢杆菌L1-21长期田间应用对CLas的影响
为了证实1年田间试验的结果， 我们在2018-2019年定期用L1-21处理了525株病柑橘园；这些定期施用减少了柑橘树中CLas的拷贝数，从而减少了病树的数量。最后，我们在525株树中随机选择了93株，分为3个重复，每重复31株树。发现在1年后，定期施用内生菌L1-21，叶中脉CLas从109拷贝/ g减少到104拷贝/ g（图7A），防效达99%（表1）。2018年4月CLas拷贝数非常高，但在3个月内下降（图7B）。2019年4月，我们发现93株病树中有16株含有100拷贝/ g，而39株病树含病菌数低于100拷贝/ g，CLas减少了91.39%（图7C），黄叶和黄梢数量减少，新梢数增多（图7D）。2019年4月，我们的检测结果表明，在内生菌处理期间，仍有25%左右病树的CLas密度没有变化，16株病树未检测到CLas存在。因此，枯草杆菌L1-21能够从病树中成功地消除CLas。
表1 2018年至2019年不同时间段柑橘黄龙病菌拷贝数的减少
图7 在2018年4月至2019年4月的整个研究期间，内生菌处理了93株柑橘病树，并监测了CLas病原菌变化
（A）利用pUC18-382重组质粒生成的标准曲线，每克柑橘叶片的病原菌拷贝数;（B）2018年4 - 9月和2019年1、3、4月柑橘树株数在不同时间间隔呈下降趋势。每个重复包含31株柑橘树;（C）每个月病原菌减少的百分比表明病原菌在减少；（D）在2018年4月柑橘叶片黄色症状，施用内生菌后，叶片逐渐转绿，不同的时间间隔每克柑橘叶片中脉的病菌拷贝由107减少至10 拷贝。
讨论
为了证明内生菌在防控柑橘灾难性病害方面的特殊作用，我们从中国柑橘种植区不同位置的有症状、无症状和健康叶片中分离并鉴定了本主内生菌（Munir等，2020a）。我们测试了枯草芽孢杆菌L1-21的功效，结果表明，在所有分离的内生菌中，枯草芽孢杆菌(B. subtilis L1-21)具有明显的粉红色菌落，可用作潜在生防内生菌。新的半叶法推进了我们清除中脉内病原菌的认识。施用内生菌对柑橘叶片中的其他微生物产生了积极影响，表明原生细菌密度没有受到影响。健康和无症状的柑橘树可能含有抑制病害的内生细菌，这些细菌可能在宿主韧皮部分泌抗菌化合物，并可能有助于防止CLas。我们发现，以LB和水作为对照处理对病柑橘叶片中的CLas拷贝数没有影响，这表明叶片内病原菌的减少是由于施用枯草杆菌L1-21作用的结果。此前，还发现柑橘内生菌，如甲基营养型杆菌（Methylobacterium）和鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas），参与保护植物免受各种破坏性病原菌的侵害（Innerebner等，2011年；Ardanov等，2012年）。
病原菌减少与病原菌和内生菌之间的营养物质竞争以及内生菌释放的可能干扰病原菌群体感应信号的物质有关，这些物质可能会干扰病原菌群体感应信号（Miller and Bassler，2001；Piewngam et al.，2018）。内生枯草芽孢杆菌L1-21经RFP标记，可以表达mKate2基因。研究结果表明，CLSM可视化清楚地显示了L1-21成功定殖在柑橘叶片韧皮部，这可能为未来研究内生菌与不可培养CLas相互作用的机制提供了新的思路。在与CLas相似的生态位中，内生菌定殖可能通过产生抗生素或脂肽、细菌素蛋白质来直接抑制病原菌（Kamada et al.，2013）。另一方面，柑橘寄主中存在的核心微生物群可能受这些内生菌的调节，从而创造了消除病原菌的可能性，最有可能的是通过诱导系统性抗性（ISR）（Perbot等，2013年；Zhao等，2018年）。
目前，在温室和田间试验中，使用抗生素（盐酸土霉素、青霉素G钾、氨苄西林等）治疗黄龙病（CLas），但这些抗生素具有植物毒性，并在果实中残留（Zhang等，2014年；Munir等，2018a）。在合适的时间、适当的剂量和正确使用抗生素可以避免与残留和药害相关的问题（McV ay等，2019年）。抗生素在农业系统中的应用对人类健康、农业生产力、自然生态系统功能、病原菌耐药性的发展以及对本地微生物群的负面影响，构成潜在威胁（Williams Nguyen et al.，2016），从而敦促实施环境友好的病害控制替代方案的出台。在柑橘园中使用抗生素是一种常见的做法，但已被证明它会大幅降低细菌群落的数量和多样性（Zhang等，2013b）。然而，关于抗生素对植物内生菌的单独作用的研究还很少。其他常见的管理措施，如在植株之间施用草甘膦，可能会随着时间的推移影响内生微生物群落。我们的田间试验表明，定期施用L1-21可以成功地减少黄龙病柑橘树中的CLas病原菌数量。罹病植株的病原菌拷贝数减少到叶片中脉<10/ g，绿叶及嫩梢的生长增加，包括在之前奄奄一息的植株中（附图S4）都有同样减少病原菌数量的现象；同时，显著提高优质商品果的数量。然而，内生菌减少CLas拷贝数和病害发展的潜在机制仍不清楚。这些结果表明了病害抑制活性，如病原菌扩散抗菌化合物的群体感应衰减，植物生长促进激素、铁载体或其他生物活性化合物的生态位和营养竞争合成，以及诱导植物防御，内生菌的田间应用可能会导致这种情况，这限制了病原菌在植物体内的传播，但需要进行详细研究（Munir等，2021年）。此外，我们认为，病原菌的减少可能与植物内生菌数量的增加有关，因为之前的研究已经证明，柑橘叶片中存在的CLas对黄龙病症状具有积极的调节作用，而对叶片微生物群具有负面的调节作用（Blaustein等，2017年；Munir等，2019年）。病原菌的减少与L1-21在病株内的数量增加有关。为了确定植物内生菌与CLas的相互作用，我们首先量化了它们在罹病植株中的预处理浓度。L1-21处理后，柑橘树内生菌数量增加，病原菌数量降低。值得注意的是，在未经治疗的病树中仍然存在高拷贝的CLas。因此，本研究证实了柑橘本主细菌的种群动态会影响CLas浓度（Sagaram等，2009年；Zhang等，2016年）。有人认为，内生菌的应用也可能通过激活植物防御或招募柑橘中导致CLas降低的其他内生菌来间接抑制病原菌。我们发现了与CLas清除相关的重要基因和途径。经过内生菌防控后，一些途径在罹病的宿主中得到了有效调节，但在健康的植株中没有得到有效调节，证实了内生菌在宿主中的不同作用（数据未显示）。
在田间条件下，施用时间和有效剂量对于生物防控非常重要（Brilli等，2019年）。在柑橘地里，在一年中的任何时候使用这种内生菌都可以达到预期的效果。随后，我们发现该内生菌在柑橘植株内的定殖时间较长，3个月后其浓度达到最大值，对农民具有很高的经济效益。使用抗生素来防控HLB病害可能会在柑橘植物中抗生素的吸收和残留方面引起极大争议(Hijaz等，2020年)。青霉素和土霉素等抗生素在柑橘植株的不同部位分布不均匀，对病害的防治效果也不明显（Al Rimawi等，2019年）。此外，在3个月的应用期间，以内生菌为代表的生物防控产品将花费100美元/公顷，柑橘种植者和整个行业可以尽量减少高成本抗生素的使用（Sundin和Wang，2018）。
柑橘树中CLas的数量与内生菌数量成反比。利用新型半叶法，以潜在生防内生菌B. subtilis L1-21处理柑橘HLB病叶的结果表明，处理罹病柑橘叶片可使叶片中脉的病原菌数量降低1000倍。此外，柑橘内生菌L1-21的韧皮部定位也证实了其可能的病原菌拮抗作用。根据我们的发现，这种内生菌可以有效地定殖柑橘叶片的韧皮部，为进一步研究内生菌与维管病原菌相互作用的机制提供了新的思路。 基于这些结果，图8给出了潜在内生菌如何导致罹病柑橘园中细菌内生微生物群的重构。结果表明，在1年内，施用内生菌可使罹病柑橘冠层内的病原菌数量由>90%降至3%以下，对农民具有很好的效益。虽然内生菌对病原菌的抑制机制还需要进一步探索，但我们对黄龙病感染柑橘的多种代谢产物的变化有了更重要的认识，这些代谢产物通过内生菌拮抗病原菌(Munir et al.， 2020b)。本研究首次揭示了本主内生菌重塑柑橘内生微生物（细菌）菌群，防控柑橘毁灭性的病害（黄龙病）。
图8 通过重构细菌内生菌来管理柑橘黄龙病，说明病柑橘田中发生的不同事件的总结示意图。
（A） 从健康柑橘植株中分离到具有明显粉红色菌落的本主内生菌L1-21；（B） 用内生菌L1-21接种病原菌多、内生菌少的柑橘病株；（C）通过定期施用1年，内生菌L1-21改变了细菌的内生菌种群，排除/限制了病原菌在两个不同地区的罹病柑橘树上的定殖；（D）恢复的植株表现出更强健的叶子和果实；（E） 施用生防内生菌枯草杆菌L1-21后，罹病柑橘宿主体内的柑橘代谢产物显著上调（Munir等，2020b）。
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附件
附表1. 本研究所用引物
|
基因 |
引物 |
引物序列（5’—3’） |
产物长度 (bp) |
参考文献 |
|
Clas 确认 |
||||
|
16S rDNA |
CAL-F |
GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA |
1160 |
Jagoueix et al., 1996 |
|
CAL-R |
GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT |
|||
|
Β-operon gene |
CG03F |
RGGGAAAGATTTTATTGGAG |
703 |
This study |
|
CG05R |
GAAAATAYCATCTCTGATATCGT |
|||
|
rplA/rplJ gene |
LAA2 |
TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT |
703 |
Hocquellet et al., 1999 |
|
LAJ5 |
ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA |
|||
|
qPCR |
||||
|
rplJ-10 |
CQULA03F |
CAAGGAAAGAGCGTAGAA |
382 |
Wang et al., 2006 |
|
CQULA03R |
CCTCAAGATCGGGTAAAG |
|||
|
rplJ-12
|
CQULA04F |
TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA |
87 |
Wang et al., 2006 |
|
CQULA04R |
CCAACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA |
|||
附表2. 以Bacillus subtilis L1-21处理第一块橘园病株号（162株）
|
处理 |
有机肥 |
||||||
|
F1 加 Y2 |
F2 不加 Y2 |
F0 (无有机肥） |
|||||
|
青霉素 |
无青霉素 |
青霉素 |
无青霉素 |
青霉素 |
无青霉素 |
||
|
内生菌注射 |
1-9* |
10-18 |
55-63 |
64-72 |
109-117 |
118-126 |
|
|
喷施 |
19-27 |
28-36 (L1-21) |
73-81 |
82-90 (L1-21) |
127-135 |
136-144 (L1-21) |
|
|
注射 |
37-45 |
46-54(CK1) |
91-99 |
100-108(CK2) |
145-153 |
154-162(CK3) |
|
|
橘园处理包括肥料F1 (含促根生长的Bacillus amyloliquefaciens Y2 (106CFU/g的油菜枯饼),F 2 (不含Bacillus amyloliquefaciens Y2油菜枯饼); F0 没有油菜枯饼. *F1：46-54，F2：100-108, F0：154-162。 青霉素只是用了54株数，仅只用1次喷雾和注射。注射青霉素后14天，施用内生菌（植株1-9， 55-63 和109-117)。 |
|||||||
附表3. 采用Bacillus subtilis L1-21和其他处理减少黄龙病菌菌量
|
天 |
Bacillus subtilis L1-21 |
青霉素 (100 µg/µl) |
LB 培养液 |
无菌水 |
|
|
104 |
106 |
||||
|
0 |
1.12×107 |
1.23×106 |
4.71×105 |
2.38×105 |
1.51×106 |
|
1 |
1.76×106 |
3.58×105 |
2.43×105 |
3.03×105 |
1.59×106 |
|
2 |
9.53×105 |
1.16×105 |
1.51×105 |
2.84×105 |
4.85×105 |
|
3 |
8.92×104 |
6.06×104 |
1.12×105 |
2.49×105 |
3.44×106 |
|
4 |
3.72×104 |
3.93×104 |
1.64×104 |
5.01×105 |
8.20×104 |
*采用半叶法检测Bacillus subtilis L1-21和其他处理减少黄龙病菌菌量。各处理包含3重复，各重复12片叶（随机的6片上半段和6片下半段），本试验共进行了5次。
附表4. 不同柑橘病叶的新半叶法试验
*每个重复随机6片上半段，6片下半段叶片，重复3次。本试验以不同叶片在不同时间段来检测叶中脉中的黄龙病菌数量，在每一天均记录病菌下降率，试验重复了3遍。下降率 = 【处理前病菌量-处理后的病菌量】*100/ 处理前病菌量。
附图1. 施用Bacillus subtilis L1-21后病田块中黄龙病菌的抑制和减少
(A) 黄色区域代表有病树的试验地位置，蓝色代表试验地位置;（B)内生菌B. subtilis L1-21应用前罹病柑橘地（黄色代表黄龙病树），总共处理了162株树；（C)绿色和结果树表示控病效果。图中1株黄色的树代表3株病树。 B. subtilis L1-21形态上有品红色菌落。
附图2. 云南省宾川县柑橘地距离试验地以外的Bacillus subtilis L1-21分布
Bacillus subtilis L1-21喷施到一个中心点上，两周后从不同方位和距离地块上收集柑橘叶片，每个误差线来自3次重复的误差（平均误）。以培养基培养来调查菌量，S和L分别表示大叶片和小叶片。L1-21在2周内可以传播到离中心100-1000米的柑橘植株上。
附图3. 云南省宾川县黄龙病地块管理的树冠
（A)三月初罹病柑橘树；（B）以内生菌防控2个月的病树，生长更为旺盛；（C -D）病橘园施用 Bacillus subtilis L1-21 6个月后，黄龙病的防效达95%，树体生长健壮，结出了一些正常果实。
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